前沿显微成像技能专题——超分辩显微成像4
战胜光学衍射极限，调查到亚细胞标准的生物结构和改变进程一直是生命科学研究的方针之一，也是超分辩显微镜诞生的意图地点。跟着现代显微成像技能的开展和不断打破，超分辩显微成像咱们庭也一直在弥补新鲜血液。不过，这些五花八门的技能各自也都存在着缺乏：比如前面几期中咱们说到的 PALM/ STORM/DNA-PAINT 等单分子定位技能都需求长期的多帧搜集，并需求高功率激起光。这在某种程度上预示着它们在很大程度上不合适对活细胞进行成像。
在超分辩显微成像专题的终究一期中，咱们将为咱们介绍一种彻底不同的，合适活细胞的超分辩显微技能——结构光照明显微成像（Structure Illumination Microscopy, SIM）。
SIM 的原理
SIM 最早是在2005年由 Mats Gustafsson 开发并提出的，其基本原理是根据莫尔条纹（Moire pattern）——一种常用于发作光学幻觉的效应。
莫尔条纹：由两个空间频率附近的周期性光栅图形叠加而构成的光学条纹。当两条线或两个物体之间以稳定的视点和频率发作干与，而人眼无法分辩这两条线或两个物体时，只能看到干与的斑纹。
这个概念听起来有点深邃，但其实莫尔条纹是一种咱们在日子中随处可见的现象（图1）。你们可以翻翻看自己穿戴条纹衬衫的相片，说不定就能看到莫尔条纹的身影哦。
图1 日子中的莫尔条纹
从图2咱们咱们可以愈加直观地了解莫尔条纹是怎么用于显现高频信息的：当两个小尺度（高频）网格叠加掩盖在最右边的图画中时，它们之间发作干与后就会显现一个较大尺度（低频）的网格，这个网格会包括两个较小网格的信息。
图2 两个彼此成必定视点堆叠的细网格彼此干与构成的莫尔条纹。From Wikimedia commons
在实际运用时，经过在照明光路中刺进一个结构光的发作设备（如光栅，空间光调制器，或许数字微镜阵列DMD等），照明光遭到调制后，构成亮度规律性改变的图画，然后经物镜投影在样品上，调制光所发作的荧光信号再被相机接纳。经过移动和旋转照明图画使其掩盖样本的各个区域，并将拍照的多幅图画用软件进行组合和重建，就可以获得该样品的超分辩率图画了。因为需求组合多个图画，SIM 的成像进程是需求必定时刻的，不过远比STORM这样的单分子定位超分辩显微技能要快许多。
还有一种速度更快的SIM技能——iSIM（Instant SIM）。它的前身是多焦点SIM（multifocal SIM，mSIM）。mSIM结合了共聚集和结构光照明——不是用线，而是用多个稀少的光点排列成图画进行照明（图2）。这些焦点由微透镜构成，并与发射光途径上的针孔相结合，到达光学切片的作用。微透镜阵列可以对来自每个照明焦点图画进行2倍的光学缩短，然后经过振镜将带有图画的激起光投射到整个样品上进行成像。Curd 等人在文章具体说明晰构建iSIM体系的进程（Curd et al., 2015.）。
iSIM 不同于 mSIM 的当地在于，它可以终究靠微透镜阵列和扫描振镜直接组合多个方位的图画，不需求经过软件，然后大幅度的提升了速度，并减少了相机噪声的影响。与PALM/STORM 等技能比较，iSIM 的速度能进步100倍。与其它结构光照明技能比较，iSIM 对样品的穿透才干要高上10倍，而且具有比转盘共聚集更好的光学切片才干，这样一来，后期反卷积处理的作用也十分好。
图3 发作多焦点激起的集聚微透镜阵列。激起样品后，用与微透镜阵列匹配的针孔阵列按捺非焦平面的杂散光。借助于第二个微透镜阵列，每个针孔发射的荧光可完成2倍缩短。振镜用于光栅多焦激起和和搜集多焦发射光，在每次曝光期间发作超分辩率图画（为明晰起见，本图仅显现部分振镜）。（York et al., 2013）
左：原始图画。右：左图的动画暗示。
SIM 的运用
SIM 和 iSIM 可以将传统光学显微镜的分辩率极限下降一半，更重要的是可以对活细胞进行超分辩成像。iSIM 可以以高达 100Hz 的频率搜集图画，而且具有更好的光学切片才干。这使得 iSIM 可以在运用传统荧光染料的一起，对生物结构内部进行3维时刻序列的超分辩成像。然后让研究人员可以打破光学分辩率极限，调查细胞和安排内微观结构的动态进程。
图4将 iSIM 与其他活细胞成像技能（转盘共聚集，线扫描共聚集）的分辩率进行了比较。这个样品的应战是线粒体内部空地中没有 Mcherry 表达，因而只有用 iSIM 才干完成超分辩（图c顶用白色箭头所示）。
图4 表达 TFAM-GFP（绿色）和 Tom20-mCherry（紫色）的MRL-TR转化人肺成纤维活体细胞。图a-c用iSIM拍照，d-f用转盘共聚集拍照，g-i用线扫描共聚集显微镜拍照。（York et al., 2013）
图a, d, g所示为3 μm体素的最大强度投影（XY），高倍图显现的为白色箭头指示区域在对应时刻点的图画。
图b, e, h: a, d, g高倍图中白色矩形区域的高倍扩大。Scalebars: 0.5μm
图c, f, i: a, d, g中黄线指示的~270 nm切片的轴向（ZY）视图。Scalebars: 1μm
内质网的运动和成长十分敏捷，新的内质网小管的构成和成长发作在约100ms的时刻标准上，iSIM 可以十分清楚地捕捉到内质网的成长进程（图5）。
图5 iSIM拍照的内质网动力学图画（100Hz）（York et al., 2013）
A：200个时刻序列中的第一张图画，显现了在MRL-TR转化人肺成纤维细胞内GFP-Sec61A符号的内质网。Scalebar：10 μm
B：A中白色大矩形区域的扩大图画。白色箭头指示内质网小管的成长，蓝色指示内质网小管的重塑。Scalebar：5 μm
C：A中白色小矩形的扩大图画，140ms内新的内质网小管构成进程。Scalebar：200 nm
运用iSIM，York等人还成功地对3日龄斑马鱼红细胞的结构进行了活体成像（图6），避免了因为运动导致的图画含糊。展现出了对活样品生物结构进行无创成像的才干。
图6 上：100个2D图画（2673ms）的最大强度投影。显现3日龄斑马鱼胚胎脑部血细胞中GFP符号的微管。成像深度：20μm；运动方向：从左到右，明晰的细胞鸿沟显现没有因为运动导致的图画含糊。Scalebar：10μm
下：上图中赤色方框在特定时刻的图画。黄色箭头：同一细胞结尾的“尾巴”结构；黄色小箭头：尾部的微管；赤色箭头：细胞内的微管。Scalebar：2μm。
合适 SIM 的科学相机
SIM 常用于进行高时刻分辩率的活体超分辩成像，高速的 sCMOS相机是它们的最佳伙伴。另一方面，因为曝光时刻短，SIM对相机搜集信号的才干要求也比较高。
2019年行将翻页，超分辩显微专题到这儿也要完毕了，下一期前沿显微成像技能专题咱们将开端介绍单分子荧光成像技能，请咱们持续重视~~
Reference
Curd, A., Cleasby, A., Makowska, K., York, A., Shroff, H., & Peckham, M. (2015).Construction of an instant structured illumination microscope. Methods, 88, 37–47. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.07.012
York, A. G., Chandris, P., Nogare, D. D., Head, J., Wawrzusin, P., Fischer, R. S., … Shroff, H. (2013).Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nature Methods, 10(11), 1122–1126. https://doi.org/10.1038/nmeth.2687
